液相色谱聚合色谱柱再生方法及操作规范

***、聚合色谱柱再生的核心原则与前期准备

再生处理的核心是在不破坏聚合填料结构（如避免交联键断裂、孔径变形）的前提下，通过选择合适的溶剂体系洗脱污染物，同时保护柱床完整性。开展再生前需完成三项关键准备工作：***是明确污染类型，结合样品基质推测污染物性质，例如生物样品常含蛋白质类污染物，环境样品可能残留强极性有机物；二是收集色谱柱基础信息，查阅说明书确认填料材质（如聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯等）、耐溶剂范围及耐受压力（通常聚合柱耐受压力低于硅胶柱，***般不超过20MPa）；三是进行柱性能基线测试，通过测定标准样品（如苯系物混合标样）的理论塔板数、分离度及对称因子，建立再生前后的性能对比基准。

二、基于污染类型的针对性再生方法

聚合色谱柱的污染可分为可逆吸附污染与不可逆沉积污染，需根据污染物与填料的相互作用机制选择洗脱策略，常用再生方法包括梯度洗脱法、特异性溶剂洗脱法及复合再生法。

（***）常规可逆吸附污染的梯度洗脱再生

对于样品中弱至中等保留强度的污染物（如多数小分子有机物、部分极性杂质），可采用梯度洗脱方式逐步增强溶剂洗脱强度，实现污染物脱附。该方法适用于日常轻度污染的常规维护，具体操作步骤如下：***先用初始流动相（如甲醇-水体系）以0.5mL/min的低流速冲洗色谱柱10个柱体积（CV），去除柱内残留样品；随后按比例梯度提升强洗脱溶剂比例，例如从甲醇-水（50:50，v/v）逐步过渡至纯甲醇（***），保持流速0.8mL/min冲洗15-20CV；若使用反相色谱模式且污染物含极性成分，可进***步用甲醇-乙腈（50:50，v/v）冲洗10CV，增强对非极性污染物的洗脱效果；***后用初始流动相平衡10-15CV，直至基线稳定。该方法对聚合填料损伤小，再生后柱效恢复率通常可达85%以上。

（二）强保留有机物污染的特异性溶剂再生

当样品中含多环芳烃、长链脂肪酸等强保留有机物时，常规梯度洗脱难以去除，需采用特异性溶剂体系破坏污染物与填料间的疏水相互作用。对于聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）类聚合柱，推荐采用“甲醇-四氢呋喃-甲醇”三步洗脱法：先用纯甲醇冲洗10CV去除表面残留，再以四氢呋喃（THF）为强洗脱剂，以0.3mL/min低速冲洗20-30CV，利用THF的强溶解能力剥离疏水吸附的污染物；由于THF对聚合填料有轻微溶胀作用，需随后用纯甲醇反向冲洗15CV，逐步收缩填料孔径并洗脱残留THF；***后用初始流动相平衡。若污染物为强极性物质（如氨基化合物），可在洗脱体系中加入0.1%（TFA），通过调节pH值减弱极性相互作用，但需注意TFA浓度不宜超过0.5%，且再生后需用含0.05%氨水的甲醇溶液中和冲洗5CV，避免酸性残留腐蚀柱床。

（三）生物大分子污染的酶解-溶剂复合再生

生物样品（如血清、尿液、植物提取液）分析后，蛋白质、核酸、多糖等生物大分子易通过疏水作用或氢键牢固吸附于聚合填料表面，甚至形成凝胶状沉积堵塞孔径，单纯溶剂洗脱效果有限。此时需采用“酶解预处理+溶剂洗脱”的复合再生策略：***先配制含蛋白酶（如胰蛋白酶，浓度0.1mg/mL）的缓冲溶液（pH7.0磷酸盐缓冲液），以0.2mL/min流速冲洗色谱柱30CV，在37℃恒温条件下静置2小时，使酶充分降解蛋白质类污染物；随后用5%甲醇水溶液冲洗10CV去除残留酶液，再按“水-甲醇-乙腈-甲醇”的顺序梯度洗脱，每个溶剂阶段冲洗15CV，流速控制在0.5mL/min；***后用含0.01%叠氮钠的甲醇溶液冲洗5CV（抑制微生物滋生），并以纯甲醇封存。该方法对生物污染柱的再生，可使理论塔板数恢复至新柱的80%以上。

（四）盐类与颗粒物污染的冲洗再生

当流动相含缓冲盐（如磷酸盐、乙酸铵）或样品含悬浮颗粒物时，易在柱入口形成盐析结晶或颗粒物沉积，导致柱压异常升高。此类污染的再生重点是“低强度溶解+物理冲洗”：***先将色谱柱反向连接（避免污染物推向柱床深处），用超纯水以0.3mL/min低速冲洗20CV，溶解盐类结晶；若柱压仍偏高，可改用5%甲醇水溶液冲洗15CV，利用甲醇的弱洗脱能力辅助去除颗粒物；对于顽固颗粒物，可采用“水-甲醇-水”交替冲洗3个循环，通过溶剂粘度变化产生的剪切力剥离沉积物。需注意，冲洗过程中压力不得超过色谱柱耐受压力的80%，且再生后需正向连接，用初始流动相平衡至基线稳定。‌

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