培养基的使用细节与规范化操作指南

***、配制前的准备

　　1. 配方确认与计算

　　- 根据实验目的选择培养基类型(如营养琼脂、LB液体、沙保弱培养基等)，严格按照标准配方称量成分。

　　- 注意特殊成分的处理：如酵母提取物、蛋白胨需充分溶解；痕量元素(如Mg²⁺、Ca²⁺)应预先溶解后添加。

　　- 计算水量时需扣除其他液体成分(如葡萄糖溶液、维生素溶液)的体积。

　　2. 容器与工具准备

　　- 使用玻璃或耐腐蚀塑料容器(如锥形瓶、培养皿)，避免金属器具直接接触培养基。

　　- 器皿需提前清洗并烘干，防止水分残留导致渗透压变化。

　　- 磁力搅拌器、pH计、电子天平等设备需校准，确保测量精度。

　　二、配制与灭菌

　　1. 溶解与混合

　　- 按配方顺序依次加入成分，先加水后加耐热物质(如琼脂)，***后添加热敏感物质(如抗生素、血清)。

　　- 加热时持续搅拌，避免局部过热导致焦糊或成分分解。

　　- 琼脂融化后需煮沸1-2分钟，确保胶体均匀分布。

　　2. pH调节

　　- 冷却至50-60℃时调节pH，使用精密pH计(误差≤0.01)逐滴加入1mol/L NaOH或HCl。

　　- 避免过度调节：每滴酸碱可影响pH约0.2-0.3，需缓慢调整至目标范围(如大肠杆菌培养基pH 7.0±0.2)。

　　- 高温下pH会因蒸发而升高，需预留0.1-0.2的补偿值。

　　3. 灭菌操作

　　- 高压蒸汽灭菌：液体培养基121℃、15分钟；含糖培养基需115℃、20分钟以防焦糖化。

　　- 过滤除菌：适用于热敏感成分(如胎牛血清)，采用0.22μm滤膜正压过滤。

　　- 灭菌后立即摇匀并冷却，避免沉淀凝结或污染。

　　三、分装与储存

　　1. 分装规范

　　- 固体培养基倒入培养皿时需均匀铺展，厚度约3-5mm，避免气泡产生。

　　- 液体培养基按实验需求分装(如试管装量不超过1/5体积，摇瓶装量为1/10)。

　　- 斜面培养基倾注后需静置凝固，形成平整斜面。

　　2. 储存条件

　　- 已灭菌培养基需在2周内使用，4℃冷藏时密封避光，防止水分蒸发或污染。

　　- 含淀粉类成分的培养基易老化，需现配现用。

　　- 添加剂(如抗生素、指示剂)宜单独储存，使用时按需加入。

　　四、接种与培养

　　1. 无菌操作

　　- 接种前用75%酒精擦拭工作台面，点燃酒精灯形成无菌区。

　　- 接种环需灼烧灭菌，待冷却后挑取菌种，避免高温杀死目标菌。

　　- 划线法接种时注意分区分离，第三区后不再返回前区，防止交叉污染。

　　2. 培养条件控制

　　- 温度：严格按菌种需求设定(如大肠杆菌37℃、乳酸菌30℃、嗜热菌55℃)。

　　- 气体环境：厌氧菌需抽真空充氮或使用厌氧罐；CO₂依赖菌需5%-10% CO₂环境。

　　- 湿度与避光：培养箱内放置水盘维持湿度，光敏感菌种需用黑袋包裹。

　　五、常见问题与应对

　　1. 污染控制

　　- 霉菌污染：多因灭菌不干净或操作时间过长，需延长灭菌时间或缩短接种流程。

　　- 细菌污染：可能来自吸管、枪头或空气，需更换无菌耗材并加强超净台维护。

　　- 支原体污染：定期检测细胞系，使用含青霉素、支原体清除剂的培养基。

　　2. 培养基异常

　　- 不凝固：琼脂浓度不足或pH过高，需补加琼脂并重新灭菌。

　　- 颜色变化：指示剂失效或成分氧化，应检查原料有效期并避光保存。

　　- 菌落形态异常：渗透压偏差或缺乏生长因子，需复核配方并补充酵母提取物等。

　　六、特殊培养基的使用要点

　　1. 选择性培养基(如麦康凯琼脂)：

　　- 胆盐、结晶紫需溶解，抑菌剂浓度需精确控制。

　　- 目标菌(如大肠杆菌)应形成典型菌落，抑制杂菌生长。

　　2. 鉴别培养基(如伊红美蓝琼脂)：

　　- 显色反应需在规定时间内观察，避免过度曝光导致颜色掩盖。

　　3. 富集培养基(如GN增菌液)：

　　- 专性菌种优先增殖，需配合选择性平板进行二次分离。

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