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实时单细胞多模态原位检测miRNA《Applied materials & Interface》

2024-02-09 09:31:15

湖北大学王升富、文为教授课题组在《Applied Materials & Interface》期刊发表***新研究成果：“Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA?Peptide?DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells ” ，研究组提出了***种由肽核酸-肽- DNA共聚物引导的内源性蛋白酶激活纳米传感器(PA-NS)，代替外源性引发剂在体外原位检测低含量的癌症生物标志物，通过实时单细胞多模态分析技术，结合电化学检测和光学成像研究PA-NS在活肿瘤细胞中对miRNA-21 (miR-21)的光电双模型检测。


图1.双模态响应的PA-NS在单个活肿瘤细胞中肿瘤特异性检测miR-21的示意图


            
研究背景
            

肿瘤生长和转移是全球癌症死亡的主要原因。肿瘤微环境的相互作用可以积极或消极地调节肿瘤的生存、增殖和进展，因此，开发快速、灵敏的分析方法来检测肿瘤内的疾病标志物是至关重要的，特别是组织蛋白酶B (CaB)是溶酶体中发现的***种内源性酶，在多种肿瘤细胞中发现蛋白酶的表达水平异常上调，能促进肿瘤血管的增殖，增强肿瘤细胞的运作能力。此外，微核糖核酸(miRNAs)是***类小的内源性非蛋白编码RNA，普遍参与基因表达和多种生物过程的调控，包括细胞分化和凋亡。miRNA的表达水平和亚细胞分布与肿瘤细胞的生长分化密切相关。因此，CaB蛋白酶和miRNA这两种促转移性生物分子的生长和表达，不仅可以让人们了解它们的生理和病理作用，而且可以为肿瘤相关转移和进***步诊断提供见解。考虑到实体肿瘤微环境中内在刺激的广泛分布，许多纳米探针已经被提出用于敏感检测miRNA或CaB蛋白酶，这些探针大多具有“永远开启”的辅助触发器，具有“随时开启”和“随时开启”的响应特征，没有理想的时空选择性或肿瘤特异性活性。这可能阻碍用于癌细胞原位监测和成像治疗的某些组件的应用，并导致治疗不足或过度治疗。
研究组提出了***种由肽核酸-肽- DNA共聚物引导的内源性蛋白酶激活纳米传感器(PA-NS)，代替外源性引发剂在体外原位检测低含量的癌症生物标志物，通过瑞明生物实时单细胞多模态分析技术结合电化学检测和光学成像在活肿瘤细胞中实现对miRNA-21 (miR-21)的光电双模型传感，而无需额外引入外源性激活剂或纳米材料。同时，PA-NS只能同时被“双钥匙”(肿瘤细胞中过表达的miR-21和组织蛋白酶B蛋白酶)激活，从而有效提高PA-NS肿瘤细胞特异性。在单个肿瘤细胞中测量的荧光强度比单个健康细胞高 ~3.5倍，并且在靶miRNA存在下电化学响应降低了~30%。该研究保证了出色的肿瘤选择性，为研究细胞异质性提供了新的机会，为低至单细胞水平的癌症诊断和治疗提供了更可靠的基础。

            
要点解析
            

要点1 PA-NS对miR-21体外光学传感的评价

为了在体外研究CaB特异性PA-NS的传感活性，研究组监测了在添加或不添加CaB的情况下，miR-21浓度升高时FAM荧光信号的恢复情况。研究结果标明，在没有CaB的情况下，随着miR-21浓度的增加，PA-NS的荧光增加不明显，这表明在没有CaB的情况下，PA-NS的传感活性被锁定。而经过CaB预处理后，随着miR-21浓度的增加，荧光明显增加，这表明PA-NS的检测活性可以被CaB“按需”激活。进***步研究将PA-NS与CaB和miR-21单独或联合孵育，结果表明PA-NS的荧光受到CaB和miR-21的共同控制。如图2c所示，PA-NS分别与CaB或miR-21孵育后，观察到几乎可以忽略不计的荧光响应。相比之下，只有当PA-NS与CaB和miR-21联合孵育时才出现明显的荧光增强，这表明成功制作了门控传感平台(图2d)。

图2.(a) PA-NS双模态检测miR-21示意图。(b)在CaB激活或未激活的情况下，PA-NS对不同浓度miR-21反应的荧光强度。(c) PA-NS与miR-21和CaB单独或联合孵育的荧光强度。(d) PA-NS检测miR-21的逻辑运算真值表(添加和不添加miR-21或CaB分别定义为“1”和“0”)(e)不同浓度的PA-NS电化学检测miR-21的I?V特性(插图为I?log C的校准曲线)


要点2单细胞水平上研究PANS探针的肿瘤特异性活性

研究组以肿瘤细胞为实验组，健康细胞为对照组。如图3b所示，利用CaB蛋白酶在肿瘤细胞中选择性激活PA-NS系统，随后通过与miR-21的位移反应诱导FAM荧光团的释放。如图3c所示，监测到活化的PA-NS探针在活肿瘤细胞中有明显的FAM荧光响应;PA-NS探针的成功激活可归因于肿瘤细胞中CaB蛋白酶的过表达，HeLa细胞中miR-21的高水平进***步触发位移反应。相比之下，由于CaB蛋白酶的低表达，PA-NS探针在健康细胞中被“锁定”(图3d)，表明PA-NS探针在健康细胞中不能被激活。如图3e所示，PA-NS释放的FAM的荧光响应几乎可以忽略不计，这表明PA-NS具有优异的肿瘤特异性活性，在临床癌症诊断和治疗方面可能具有相当大的应用潜力。
      随后，用微光纤(~ 10 μm)收集单个活肿瘤和健康细胞的荧光信号，进***步证明了肿瘤特异性活性。***先，将PA-NS转染到肿瘤细胞中，再孵育3.5 h，激活探针并释放FAM荧光信号。然后，利用三轴微操作系统将微光纤精确地附着在细胞膜上。在微光纤的辅助下，将495nm的激发光引导至单个活细胞，激活FAM荧光信号。如图3f所示，微光纤辐照后细胞形态和细胞活力几乎不受影响，说明微光纤对细胞活性的影响可以忽略不计。然后用光电倍增管(PMT)收集并记录单个活细胞的荧光信号。利用微光纤分别监测单个肿瘤细胞和健康细胞释放的FAM信号。如图3g所示，通过PMT获取6个单个肿瘤细胞和健康细胞释放的FAM荧光信号，并用微光纤进行定量分析。我们看到肿瘤细胞释放的荧光强度远高于健康细胞，证实PA-NS在肿瘤细胞中可以被特异性激活，在健康细胞中处于“停止”状态。考虑到细胞的异质性，从20个单个活肿瘤细胞和健康细胞中收集相应的统计结果，揭示了荧光强度的变化。如图3h所示，在单细胞水平上，肿瘤细胞的荧光强度值比健康细胞高约3.4倍，比空白组高约5.1倍，这与荧光成像结果吻合良好。此外，健康细胞的荧光强度比空白组高~ 1.55倍，表明PA-NS具有令人满意的肿瘤特异性活性和对肿瘤细胞的低背景信号。

图3.(a)用Lip3000转染PA-NS的过程。(b) PA-NS在肿瘤细胞中的活化过程。(d) PA-NS在健康细胞中的反应。高分辨率荧光显微镜图像显示PA-NS对肿瘤细胞(HeLa细胞)(c)和健康细胞(HUVEC细胞)(e)的反应。(f)高分辨率荧光显微镜图像显示靠近细胞的微光纤:(i)无激发的亮场;(ii)在约490 nm处激发;(iii)与赫斯特病毒孵育;(四)合并图像。(g)利用微光纤检测PA-NS在单个活肿瘤细胞和健康细胞中的荧光响应。(h)利用微光纤，PA-NS对单个活肿瘤细胞和健康细胞的对应荧光强度(490nm)箱形图。标尺:20 μm。

要点3 miR-21在单个活细胞中的原位光学定性和电化学定量分析

为了验证在单个活细胞中同时进行光学和电化学检测miR-21的可行性，***先，评估了用电极插入细胞并同时用微光纤将其连接到同***细胞上的操作可行性。如图4a所示，在双边三轴微操作系统的帮助下，纳米电极和微光纤被引导并移动到同***个单细胞中。用微光纤监测了单个肿瘤细胞60s内荧光强度的变化。如图4b所示，观察到***个“signal-on”荧光信号，荧光强度在60s内趋于稳定，说明FAM荧光信号具有良好的稳定性和低背景信号。考虑到细胞的异质性，收集并测量了几种肿瘤细胞的荧光强度。如图4c所示，肿瘤细胞的荧光响应比空白组高~ 5倍，证明PA-NS可以在肿瘤细胞中被激活，并借助微光纤实现单细胞水平的光学分析。接下来，评估了用修饰的Au NE在单个活细胞中电化学检测miR-21的可行性。如图4d所示，通过三轴微操作系统控制和引导修饰后的Au NE附着在细胞上，然后通过倒置显微镜上安装的微操作器调节纳米电极并插入细胞(图4e)。考虑到细胞的异质性，对15个单个活肿瘤细胞收集并分析相应的统计结果。如图4f所示，纳米电极与肿瘤细胞孵育后，电化学信号下降了约40% (***P < 0.001;平均值±SD = 1.00±0.09 vs 0.62±0.09)，表明PA-NS涉及双模型信号输出平台，可以检测单个活肿瘤细胞中的miR-21。

图4.(a)显示插入单细胞的纳米电极和用于单细胞光子数收集的光源引导的微光纤的显微图像。(b)微光纤采集的肿瘤细胞荧光强度。(c)使用微光纤对单个肿瘤细胞的荧光强度进行相应的直方图统计。纳米电极在细胞外(d)和插入细胞内(e)。(f) 15个单个活肿瘤细胞对应的电流框图。标尺:20 μm。

技术简介
            
单细胞分析技术因具有理想的时空分辨率以监测细胞成分已经获得了大量的关注。单细胞分析旨在阐明细胞的异质性和细胞信号转导的动力学，而不是群体平均，以帮助准确的病理检查，特别是***些与癌症的早期诊断和治疗密切相关低含量的物质，如miRNA。此外，在单个活细胞中原位分析miR-21不仅可以提供miR-21在细胞不同部位分布的精确信息，还可以研究其在癌症发展中的增殖和转移。细胞成分的电化学分析依赖于特定的微创纳米设备，这些设备可以在不破坏细胞活力的情况下进入细胞内环境，从而能够在单个活细胞的理想位置进行原位定量分析，甚至可以从单个细胞中提取特定结构(例如，细胞核，线粒体，溶酶体)。然而，电化学传感器的选择性和通用性仍然不足。与电化学分析相比，光学检测在微/纳米光纤的辅助下，通过荧光成像和单个活细胞的原位荧光分析，可以同时对多种细胞成分进行定性分析，具有高通量和直观观察的优点。然而，荧光探针可能的光漂白、低组织渗透活性和有限的空间定位能力可能会阻碍其在细胞水平上持续稳定分析的应用。因此，设计***种具有光学和电化学响应的互补纳米探针，同时对单个活细胞进行原位定量和定性分析是必要的。此外，双信号读出也可以有效地减少假阳性和假阴性结果，进***步提高测量精度。

实时单细胞多模态分析仪 

瑞明生物实时单细胞多模态分析仪主要性能

1、实时单细胞多指标检测：实时检测单个活细胞内小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、胆固醇、Ca2+、K+等）及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脱氢酶等），可匹配160余种商品化试剂盒；

2、实时亚细胞原位检测：在亚细胞水平（胞质、胞核、胞膜）实现实时连续、原位检测；

3、超微量提取、注射：单细胞水平提取细胞器（如溶酶体、线粒体）、胞质进行质谱或其它平台的联用分析；单细胞注射药物、代谢剂等，并进行药效或机制评价；

4、活体水平检测：活体水平实时检测生化指标（用药前后、中医药针灸刺激前后）的变化。a

(文章来源于仪器网)

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