荧光入门介绍

荧光是George Gabriel Stokes于1852年***次报道的***种现象。他观察到萤石在紫外线照射后开始发光。荧光是光致发光的***种形式，是指***种材料被光照射后会发射出光子。发射光的波长比激发光更长。这种效应又称为斯托克斯位移。

以荧光为工具在显微镜中的应用

荧光在显微镜中有着广泛的应用，是观察特定分子分布的重要工具。细胞中的绝大多数分子并不会发出荧光，因此必须用荧光分子即所谓的荧光素进行标记。对于感兴趣的分子可以直接标记（例如，用DAPI标记DNA），或者使用可与特异性抗体偶联的荧光素进行免疫染色。免疫染色时通常必须对细胞进行固定。

荧光显微镜还可对活细胞或组织进行延时成像。为此，对于感兴趣的蛋白质可以使用基因编码的荧光分子进行标记，如GFP（绿色荧光蛋白）。对于感兴趣的分子（如Ca2+）还可以使用可逆结合的合成染料（如fura-2）或转基因天然蛋白质（如GFP衍生物）进行标记。

图1：当特定波长（激发波长）的光照射到分子上（例如照射到荧光团中）时，光子会被分子的电子吸收。然后，电子从它们的基态(S0)提升到更高的能***，即激发态(S1’)。这个过程被称为激发(1)。激发态寿命很短(通常为10-9/-10-8秒)，在此期间电子的***些能量会丢失(2)。当电子离开激发态(S1)返回基态(3)时，它们会失去在激发过程中获得的剩余能量。荧光团的获得的能量会以光子形式释放，释放的光子波长以比激发光波长更长，从而能量更少。这种现象被称为斯托克斯位移。

图2：COS 7细胞，绿色：无特征蛋白质，GFP，红色：α-微管蛋白，Cy3，蓝色：细胞核，DAPI。感谢中***上海SIBS、CAS、生物化学与细胞生物学研究所边玮提供的图片。

图3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-肌动蛋白，FITC，红色：微管蛋白，Cy5，蓝色：细胞核，DAPI。感谢德***海德堡Max Planck医学研究所Günter Giese博士提供的图片。

图4：小鼠原代海马神经元细胞，蓝色：转染细胞标记；绿色：肌动蛋白，TRITC；红色：GluA Ampa受体单位，Texas Red；灰色：突触小泡蛋白，Cy 5

图5：果蝇幼虫，绿色：RNA结合蛋白，Alexa 488

磷光的机制原理

由于磷光分子发光的时间比荧光素长得多，因此它们储存激发能量的方式肯定有所不同。这种差异的基础在于两种形式的激发能***，即单重激发态和三重激发态都基于不同的自旋排列。

自旋是电子的***种属性。简单来说，自旋描述了由电子旋转引起的角动量。电子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是负方向（−1/2）。更高能***的自旋配对可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配对中，单个角动量相互补偿，同时自旋总值为零。这种自旋排列就称为单重态。两种平行自旋互不补偿且所得数值不同于零值，在这种情况下，自旋被称为三重态。

当电子从单重态激发态回到基态时，就会产生荧光。但在某些分子中，被激发电子的自旋可以在***种称为系统间交叉的过程中转换为三重态。这些电子失去能量，直到它们处于三重基态。这种态比基态具有更高的能量，但也比单重态激发态具有更低的能量。因此，电子无法切换回单重态，也不能轻易地返回基态，因为量子力学只允许自旋总值为零。因此分子被困在其能量状态当中。

但从三重基态到基态的***些变化有时还是有可能的。这些变化会发射出光子和磷光。由于***次只有少数事件可能发生，三重基态呈现为能量储库的形式，因此能够在更长的***段时间内发出磷光。

冷发光在显微镜中的应用

对于显微镜，荧光是***为实用的***种冷发光。荧光素可以很容易地通过特定的光源（如灯和滤光系统或激光器）在特定波长下激发，发射光和激发光可以通过波长来加以区分（斯托克斯位移）。

利用荧光成像，实验室人员可以对细胞内的分子数量和位置进行特征描述。荧光显微镜的另***个优点是可以同时使用几种荧光素。荧光素只需其激发和发射波长不同即可。因此，不同目标分子均可同时观察并开展大量的实验，例如开展共定位的研究等。

图6：果蝇，幼虫龄期，绿色：Feb211阳性神经元及其轴突，Alexa 488；红色：CNS纤维部分（即所有轴突），Cy3；蓝色：细胞核，DAPI。感谢德***Eggenstein-Leopoldshafen毒理学与遗传基因研究所，Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的图片。

图7：小鼠肾脏切片，绿色：肾小球和肾曲小管，Alexa 488 WGA；红色：F-肌动蛋白（普遍存在于肾小球和刷状缘）；蓝色：细胞核，DAPI

图8：新生心肌细胞，黄色：DNA，DAPI；绿色：肌间蛋白，Cy3；红色：钙粘蛋白，Texas Red；蓝色：肌动蛋白，Alexa 633

图9：荧光显微镜下获得的分裂中期FISH染色染色体。感谢东京大学前沿科学研究生院人类进化实验室Yumiko Suto博士提供的图片。

(文章来源于仪器网)